CINETICA ENZIMATICA

Buongiorno a tutti, dopo una cattiva mattinata passata a cercare  funghi nella val brembana fino nella zona di lecco sono tornato e dopo un riposino ho deciso di scrivere il post sulla cinetica enzimatica. Premetto che questa parte è molto importante per capire come un enzima opera e come reagisce in funzione del suo substrato, sopratutto lo studio del primo grafico che trovate sotto.

la cinetica enzimatica è un argomento ultra trattato e oltre a questa guida troverete migliaia di altre guide nel web, bene ora procediamo:) buona lettura a tutti !

             

La cinetica enzimatica studia la velocità di reazione di un enzima al variare delle condizioni di reazione

Di seguito si vedrà un grafico che porta tutte le caratteristiche di un enzima che reagisce con un certo substrato, la premessa è che questi grafici sono tratti da esperimenti fatti dove la concentrazione del substrato è saturante.

 La retta S indica la concentrazione del substrato che nel tempo diminuisce perché reagisce con l’enzima e si trasforma nel prodotto P, e infatti vediamo che P aumenta proporzionalmente alla diminuzione di S.

Le rette che invece vediamo sotto sono E cioè l’enzima libero che diminuisce la sua concentrazione perché reagisce con il substrato e forma un complesso enzima substrato, poi abbiamo una parte costante determinata dal fatto che siamo nello stato stazionario e poi un aumento della sua concentrazione fino a al valore iniziale, e corrisponde a quando l’enzima ha finito la sua reazione con tutto il suo substrato (questi punti coincidono con il primo punto di massimo della retta dei prodotti e il primo punto di minimo della retta del substrato.)

L’ultima retta rimasta è quella ES cioè quella del complesso enzima-substrato, inizialmente la sua concentrazione è zero, poi aumenta vertiginosamente fino a un picco massimo che corrisponde al momento in cui tutto l’enzima è saturato, da questo punto in avanti si dice che siamo nella fase stazionaria, fino all’esaurimento di substrato.

Durante la fase stazionaria è possibile calcolare la velocità di reazione che si registra lungo questo stadio, che essendo la fase più lunga è quella che determina la velocità globale, si calcola facendo:

(derivata concentrazione del complesso enzima-substrato)/( derivata del tempo)

Oltre a questa velocità  è necessario capire la velocità massima dell’enzima e la si calcola trovando la V₀, cioè la velocità iniziale di reazione, la si calcola qua perché in tal modo non è necessario considerare  la diminuzione di concentrazione del substrato e siamo in una situazione invece di substrato saturante.

Come si nota inizialmente la velocità è funzione della concentrazione di substrato presente, ma poi questa diminuisce dando il via a una cinetica di ordine zero, dove la velocità non è più funzione della concentrazione di substrato.

Si considera a volte un dato chiamato KM, cioè la concentrazione di substrato uguale a ½ V massima.

È utile considerare che la velocità di reazione è dipendente dalla natura del substrato

Victor Henri disse che: “ la catalisi enzimatica ha inizio con la formazione del complesso enzima substrato”

Ragion per cui la velocità dell’enzima è quindi funzione non solo del substrato ma anche della stabilità che il complesso enzima-substrato ha.

V= velocità iniziale
Vman= velocità massima
[S]= concentrazione substrato
Km= costante di michaelis

Con questa formula possiamo trovare la velocità iniziale partendo da delle semplici costanti che sono proprietà dei reagenti (il che dimostra l’affermazione che la velocità dipende anche dalla natura del substrato)

MICHAELIS – MENTEN

L’equazione di Michaelis – Menten (M&M) studia la velocità di reazione alla variazione della concentrazione di un substrato.

L’equazione che troviamo studia la relazione tra la velocità la concentrazione del substrato catalizzato allo stato stazionario.

L’equazione è ricavabile dallo studio di una reazione enzimatica, vista passaggio per passaggio.

La prima tappa consiste nella formazione del complesso enzima-substrato

La seconda tappa di una reazione enzimatica è quella di passare dal complesso enzima-substrato alla formazione del prodotto, il tutto si riassume nell’equazione sopra.

K1 e K2 sono le costanti di  associazione, mentre la K-1 è la costante di dissociazione del complesso enzima substrato

La seconda tappa è la fase più lenta, e per sapere la velocità di reazione calcoliamo la velocità di questo passassio:

 V₀= K2 *[ES]

Premessa, dobbiamo considerare queste condizioni logiche iniziali:

[enzima totale]= [enzima libero] +[ES]

Velocità di formazione di ES = K1*([Etotale]-[ES])*[S]

Velocità di dissociazione di ES = K-1*([ES])+ K2*[ES]

Visto che stiamo considerando lo stato stazionario, dove la concentrazione di ES che si forma e si dissocia è uguale allora possiamo scrivere la formula cosi

K1*([Etotale]-[ES])*[S]= K-1*([ES])+ K2*[ES]

(nel secondo membro consideriamo sia la reazione che vede la dissociazione di ES sia quella che prevede la trasformazione del substrato nel complesso ES in prodotto, il che risulta sempre una dissociazione)

Da questa equazione ricaviamo ES e otteniamo:

Dall’equazione sopra possiamo isolare il membro (K2 + K1)/K1 , questo membro isolato dall’equazione corrisponde a una  costante chiamata Km.

A questo punto abbiamo detto inizialmente che la velocità di reazione allo stato stazionario era dato dal prodotto di K2 per la concentrazione del complesso enzima-substrato, a questa concentrazione possiamo sostituire la formula ricavata sopra e ottenere:

 

Sostituendo (K2+K1)/K1 l’unica costante che ci rimane è K2 ma che moltiplicata con la concentrazione dell’enzima totale ci permette di sostituire questi due dati con la velocità massima della reazione perché K2* [E]= V max.

Cosi otteniamo l’equazione di M&M

 

STUDIO DELL’EQUAZIONE DI M&M

Dallo studio dell’equazione, il primo parametro da studiare è la Km, una costante che varia in associazione all’enzima usato e al tipo di reazione che consideriamo, è una costante derivante da altre costanti di associazione e dissociazione dell’enzima stesso.

È possibile calcolare la Km anche praticamente mediante un grafico, la sua utilità sta nel determinare se l’enzima è affine o no al substrato: se la Km è molto piccola, l’affinita enzima- substrato è grande se invece la Km è grande la sua affinità ne risente.

Un'altra costante che possiamo trovare è il numero di turnover, chiamato Kcad, questa costante si calcola facendo la Vmax/[E], è quindi una costante calcolabile sperimentalmente e non rientra nell’equazione di M&M.

La Kcad serve per avere un indice della velocità di ricircolo del’enzima nella reazione, in poche parole serve per capire se l’enzima usato è buono nei confronti del substrato.

Usare queste due costanti è necessario per calcolare l’efficienza dell’enzima.

La formula usata è Kcad/Km, in tal modo possiamo vedere se l’enzima è efficace o no, un ottimo grado di efficienza lo otteniamo con una Kcad alta e una Km bassa, ma se queste condizioni non sussistono, può essere che un valore compensi leggermente altro, rendendo comunque efficiente l’enzima.

 È utile poi aggiungere che non tutti gli enzimi seguono la cinetica di M&M

GRAFICO DI LINEWEAVER- BURK

Questo ti po di grafico è chiamato anche grafico dei doppi reciproci, è una manipolazione matematica dell’equazione di M&M, questa equazione graficamente porta all’origine di una parabola che tende a un valore Y sul grafico.

da questo grafico possiamo solo vedere che la velocità dell’enzima è funzione della concentrazione del substrato e che tende a un valore che è la velocità massima a cui l’enzima può operare.

Da questo grafico non è possibile invece estrapolare dati come il valore della velocità, o della costante Km e di conseguenza sapere il valore dell’efficienza o il numero di turnover.

Un metodo per calcolare questi dati  è sfruttare il grafico dei doppi reciproci che lo si trova mediante un elaborazione matematica della formula di M&M.

Se facciamo il reciproco della formula di M&M otteniamo:

1/Vo = ( Km +[S])/(Vmax*[S])

Scomponendo la seguente formula otteniamo:

1/Vo = KM/Vmax *(1/[S]) + 1/Vmax

Questa equazione è una retta, quindi tracciando il grafico di questa retta possiamo trovare la Vmax facendo il reciproco dell’intersezione della retta con l’ordinata Y e trovare la Km con l’intersezione con l’ascissa X

1/Vman= Y dove si interseca --> Vmax= 1/Y

1/Km= X dove interseca con la retta --> Km= 1/X

Bene e anche questo post lo chiudo qui :) spero possa esservi utile, volevo mettere dentro anche alcuni esempi di enzimi ma credo sia meglio farlo in un post separato in modo da spezzare di più l'argomento, inoltre il mi sembra già abbastanza lungo e complesso pieno di formule e calcoli, spero di averlo scritto bene senza troppi errori nel caso lasciate un commento e provvederò a sistemare buona lettura neo studiosi e non ! :)