LE PROTEINE - PARTE 3

Buongiorno a tutti con oggi concludo la guida alle proteine :) l'ho scritta come sempre di mio pugno quindi potrebbero esserci degli errorini di forma >.< buona lettura e buono studio ( mi scuso se non l'ho finita prima ma ho avuto alcuni problemi tra cui uno era con un dente maledetto)

STRUTTURA DELLA PROTEINE

PROTEINA CON STRUTTURA PRIMARIA

È una proteina che non ha subito un ripiegamento e la possiamo trovare quindi in una forma lineare

PROTEINE CON STRUTTURA SECONDARIA

Questo genere di conformazione è un po’ più complesso rispetto a quella vista precedentemente e prima di noi la spiego un celebre scienziato padre della scoperta delle proteine, cioè pouling, enunciò dei postulati che devono verificarsi per far si che una struttura in conformazione 3D possa essere stabile e non crollare

1. una conformazione proteica 3D deve avere la lunghezza di legame e i loro angoli devono il più possibile simili alla loro struttura se fosse lineare
2. Due gruppi R di due amminoacidi di una catena proteica ripiegata non devono avvicinarsi troppo e rispettare i raggi di van der waals ( la distanza dei due atomi di due gruppi R deve essere maggiore della somma dei due raggi atomici, se cosi non fosse si creerebbe un fenomeno di repulsione)
3. il legame peptidico deve rimanere in una conformazione planare e in configurazione trans
4. La struttura deve essere stabilizzata dalla presenza di legami  a idrogeno e in generale legami non covalenti.

La struttura secondaria delle proteine non è una struttura univoca ma bensì è presente in 2 diverse forme, la forma alfa elica e beta foglietto, queste due forme hanno una diversa conformazione diverse proprietà e diversi effetti quando si trovano all’interno di una proteina.

La struttura secondaria è determinata dagli angoli diedrici dei legami peptidici.

È importante considerare che la rotazione lungo questi legami è limitata dall’ingombro sterico che il gruppo carbonilico da nel momento della sua rotazione con il gruppo R dell’amminoacido vicino, questo fa si che solo alcuni valori di angoli possano verificarsi quando la proteina si trova in una determinata conformazione 3D

Per determinare se la struttura secondaria è di tipo alfa elica o beta foglietto è necessario conoscere gli angoli diedrici, successivamente grazie a un grafico chiamato grafico di Remachedran si inseriscono i valori degli angoli diedrici dei legami N-Calfa e Calfa-C ( come si vede in figura) e in base alla posizione nel grafico si stabilisce l’ipotetica struttura.

 ALFA ELICA

La struttura alfa elica ha una struttura destrogiro, una rotazione sinistrosa non avviene perché tutti gli amminoacidi D creano una struttura instabile ( la glicina può formare eliche sinistrose ma solo per piccoli segmenti)

Gli angoli diedrici sono tipicamente negativi Ψ= -50° e Φ= -60

I legami a idrogeno stabilizzano invece l’intera struttura e i gruppi R sono proiettati verso l’esterno in modo da non creare ingombro sterico verso l’interno.

Il numero di residui e la lunghezza che formano un passo dell’elica può variare in base alla catena aminoacidica che  forma il nostro peptide, ma generalmente una struttura alfa elica ha un passo formato da 13 atomi (il numero di atomi che forma un passo dell’elica si scrive anche nel nome insieme alla lunghezza di un giro, per esempio alfa elica 3,6₁₃. Quel 3,6 è la lunghezza del giro dell’elica mentre il 13 come pedice è il numero di atomi per passo.).

L’orientazione dei gruppi polari viene mantenuta costante nella struttura in modo che non ci sia la formazione di un dipolo con  N positivo e C negativo

La stabilità della catena polipeptidica è determinata dalla catena laterale R di ogni amminoacido che la forma, infatti catene molto ingombranti si addicono poso a una struttura secondaria perché la destabilizzano, per fare un esempio pratico la prolina, l’amminoacido con il gruppo R ciclico destabilizza la struttura secondaria, quindi sarà difficile trovare una prolina in una struttura secondaria ( la prolina la troviamo in quelle poche catene proteiche che hanno una struttura secondaria sinistrosa)

Questo tipo di struttura proteica fu scoperta da Perutz con l’analisi ai raggi x dell’alfa cheratina.

Le proteine globulari sono ricche di strutture alfa elica, perché queste hanno una capacità elastica rispetto ad altre strutture e quindi sono più competenti a maggiori ripiegamenti o torsioni

ESEMPIOà una struttura tipica dell’alfa elica è la proteina antigelo presente in quei mammiferi che si trovano a vivere in condizioni di temperatura sotto lo 0, in tal modo evita che l’acqua nel organismo geli, la proteina riesce a fare ciò grazie alla una proprietà polare che gli permette di legarsi ai cristalli di ghiaccio in formazione ed evitare che si ingrandiscano non facendo congelare l’acqua.

Tra i gruppi R della catena polipeptidica possono avvenire delle medie o forti interazioni che possono anche portare un contributo in termini di stabilità alla struttura.

Il numero di residui che la struttura alfa elica ha per giro è fondamentale perché la loro variazione determina una modificazione della struttura proteica stessa.

 BETA FOGLIETTO

La struttura a beta foglietto o foglietto ripiegato ha un estensione della sua ripiegatura di circa 35 nm e la sua robustezza non che compattezza è dovuta ai legami a idrogeno, questo genere di struttura proteica è usata in molte occasione per costituire una zona resistente alle azioni di proteasi batteriche.

La struttura puo essere in parallelo o in antiparallelo, la differenza sta nell’allineamento o meno dei gruppi R di vari amminoacidi delle varie catene.

I legami a idrogeno sono quasi perpendicolari a queste catene di polipeptidi, e i gruppi R sono proiettati sempre verso punti diversi, o in alto o in basso, non ci saranno mai due catene R contigue che li proiettano entrambe nella stessa direzione, questo genererebbe una situazione più instabile.

L’aspetto a foglietto ripiegato è dovuto agli angoli diedrici una positivo e uno negativo che fanno cambiare l’orientazione nello spazio alla molecola Ψ= -130° e Φ= +140.

La lunghezza del passo della catena peptidica di questa struttura varia da 6,4 se parallele a 6,8 se antiparallele, il numero di residui varia anche lui con la lunghezza, rispettivamente 3,4 e 3,2

Una caratteristica dei foglietti beta è che a volte cambiano la loro direzione, questo è dovuto a amminoacidi come la prolina e alla presenza di legami a idrogeno che stabilizzano la struttura

Alcune strutture secondarie ripetute all’interno di una proteina possono dare vita a proteina fibrose, che sono formate da strutture alfa elica che danno alla struttura globale una buona capacità di resistenza meccanica o proteine globulari che contengono invece sia elementi alfa elica che beta foglietto

Alcuni esempi pratici possiamo trovarli nello studio della cheratina, struttura alfa elica che determina un forte impaccamento della struttura e alta rigidità, molti dimeri di una struttura base formano un proto filamento che poi costituisce appunto l’alfa cheratina.

O ancora la fibroina della seta, una struttura formata da sole glicine e alanine.

PROTEINE CON STRUTTURA TERZIARIA

È una struttura proteina che è ripiegata su se stesso formando una struttura circolare formata da un core, il nucleo della proteina idrofobico e da una parte esterna che invece i idrofilico e sta bene a contatto con acqua

PROTEINE CON STRUTTURA QUATERNARIA

La struttura quaternaria è un insieme di altre strutture proteiche e possono essere formate da proteine compatibili tra loro ma che non hanno pero stesse funzioni e proprietà, ogni proteina lega all’altra mediante legami a disolfuro o solo con legami di tipo ionici o a idrogeno legami più deboli ma che rendono la struttura compatta.

COME STUDIARE LE PROTEINE

1. separate le proteine e isolare quelle a cui siamo interessati, questo non è un processo facile perché in una cellula ci sono un grandissimo numero di proteine, tra i 20.000 e 30.000 tipi
2. determinare da che tipi di amminoacidi è costituita la proteina sotto il nostro studio ( trovare la % di amminoacidi di cui è formata la proteina)
3. determinare il primo e l’ultimo amminoacido della struttura proteica
4. determinare la sequenza di amminoacidi
5. determinare la struttura 3D della proteina
6. Studiarne le funzioni.

Il primo processo è quello più laborioso da fare in un laboratorio e riede precisione e lavorare per punti in modo da eseguire tutti i passaggi e separare le proteine dalle componenti cellulare e poi isolare la proteina in esame

1. per prima cosa si deve raccogliere le cellule per centrifugazione e successivamente devo rompere le cellule per far uscire il contenuto cellulare tra cui troviamo le proteine
2. separo la parte pesante della cellula (pezzi di membrana e organelli vari)
3. Purifico la proteina interessata, cioè la separo dal resto.

Per separare le proteine è necessario sfruttare le loro proprietà cioè peso,carica e solubilità, usare dei reagenti chimici come il solfato d’ammonio, che come si sa è un forte disidratante, permette di eliminare quelle molecole di acqua vicine alle proteine e in questo modo esse precipitano.

Oltre a questo metodo è possibile sfruttare il punto isoelettrico della proteina, che corrisponde al punto di minor solubilità.

Esempio, la mioglobina ha un PI di 7, il che vuol dire che tenendo il ph il più vicino possibile a 7 e usando un po di solfato d’ammonio queste proteine precipiteranno, questi processi sfruttano la caratteristica della solubilità

In questo modo non separo tutte le proteine ma solo una certa frazione, per separare invece una certa proteina sfrutto un altro processo che è quello della cromatografia a scambio ionico che sfrutta resine cationiche o anioniche, e questo processo sfrutta la caratteristica della carica di una proteina

Oltre a queste due metodiche posso anche sfruttare un altro metodo di separazione, sfruttando la caratteristica del peso della proteina, più una proteina è pesante e formata da atomi più essa sarà grande, percui usando un processo cromatografico con maglie della grandezza della proteina di interesse separero quella proteina in particolare e tutte quelli più grandi.

Esiste ancora un altro processo chiamato cromatografia ad affinità, che separa le proteine di interesse usando un antigene che si leghi selettivamente ad esse, isolando in tal modo una concentrazione stechiometrica alla concentrazione dell’antigene.

Molte di queste metodiche sono applicate anche per test più specifici come il test ELISA che viene fatto per trovare una certa sostanza come un antigene o molecole più piccole chiamate apteni.

ELETTROFORESI

Una metodo efficace per separare le proteine è tramite l’utilizzo di un processo chiamato l’elettroforesi, si crea una carica negativa sulle proteine che sono all’interno di una soluzione, poi viene posizionato un uno strumento che crea due poli uno positivo e uno negativo, la carica negativa sarà posta in alto mentre quelle positiva in basso, in tal modo le proteine caricate tutte negativamente si muoveranno di diversa velocità verso il basso.

Questo metodo è usato per determinare la grandezza delle proteine in analisi, per creare la carica negativa sulle proteine usiamo un reagente chimico chiamato SDS questa sostanza si lega alle proteine, e più la proteine è grande e più molecole di SDS si legano ad essa (ogni 2 amminoacidi si lega una molecola di SDS), quindi più la proteina è grande e più grande sarà la carica su essa, ma il rapporto massa/carica viene sempre rispettato quindi le proteine più piccole si muoveranno più velocemente verso il polo positivo mentre quelle più grandi migrano più lentamente.

ELETTROFORESI BIDIMENSIONALE

Un altro tipo di elettroforesi è chiamata elettroforesi bidimensionale, questo processo serve per separare maggiormente quelle proteine che hanno un peso molecolare simile da non distinguersi molto in una singola elettroforesi, per farla si prende semplicemente il campione della prima elettroforesi e ruotando il tubo orizzontalmente lo si colloca ancora in un apparecchio per l’elettroforesi e si da il via a una seconda analisi.

e con qua concludo, so che è un post un pochino lungo ma serve per non fare perdere il filo di tutto il discorso, anzi consiglio di copiare in un unica pagina word i 3 post e poi stamparli e leggerli nel complesso, le prossime guide come detto saranno su lipidi e zuccheri e prossimissimamante passeremo a trattare gli enzimi :) nel mezzo mi prendo anche la libertà di pubblicare qualche articolo di carattere biologico/biotecnologico al prossimo post !:)