BIOCHIMICA (metodiche di laboratorio)

LA CINETICA DI CRESCITA

INTRODUZIONE

La cinetica di crescita è una procedura svolta a monitorare in quanto tempo un linea cellulare cresce in un determinato terreno, generalmente si piastra a bassa densità in terreno standard e le si lascia crescere per 24 ore, poi scaduto il tempo si procede con il cambio medium e a contare i primi pozzetti, ottenendo cosi il numero di cellule  al tempo zero della cinetica.

I pozzetti che non abbiamo contato li lasciamo crescere in incubatore per X ore per poi alla fine contare anche in loro il numero di cellule presenti.

La crescita delle cellule è esponenziale quindi è essenziale partire da una concentrazione di cellule ideale per evitare che poi a tempi alti della cinetica si arrivi a situazioni di over-confluenza.

Una cinetica  viene fatta  in diverse condizioni e tempi in relazione alle cellule che stiamo usando, nel caso che abbiamo trattato in laboratorio abbiamo visto  linee cellulari di tumore umano HCT 116 e HT29 che hanno tempi di duplicazione abbastanza alti, quindi per la nostra cinetica abbiamo dovuto usare  tempi  dilatati di 24 h, 48 h e 72 h ore, ma se è possibile anche a tempi superiori come a 144 ore.

Una cinetica con cellule batteriche o lieviti invece richiede tempi notevolmente minori perché il loro tempo di duplicazione è molto più basso.

La cinetica di crescita è molto utile perché permette anche di poter comparare la crescita di linee cellulari su diversi terreni e poter evidenziare in quale dei terreni le nostre cellule crescono meglio.

Come per ogni esperimento, ogni singolo pozzetto che andiamo a contare per ogni condizione deve essere replicato per più volte in modo tale da ottenere dei valori privi di errori causali o sistematici e ottenere un dato più veritiero possibile riguardo alla nostra linea cellulare. 

In  laboratorio abbiamo fatto 3 duplicati di ogni pozzetto, cosi da poter poi calcolare un valore medio da inserire nel grafico finale.

    

 
CONTA VITALE

 Quando parliamo di conta cellulare si intende una conta totale, cioè una conta che tenga in considerazione tutte le cellule vive più tutte le cellule morte che sono presenti.

Si rende necessario per alcuni test fare un altro tipo di conta, cioè una conta vitale, ovvero la conta esclusiva di quelle cellule che non sono morto. 

Per discriminare le cellule vive da quelle morte usiamo il Trypan Blu, un composto chimico che entra nelle cellule morte e le da una colorazione blu, nelle cellule vive invece il colorante non riesce a penetrare, in questo modo quando andiamo a caricare su una camera di burker il composto colorato per contare le cellule, conteremo solo quelle che sono “luminose”, che sono cellule vive che non hanno fatto entrare nel citoplasma il colorante, mentre non conteremo tutti quei corpi cellulari che hanno una colorazione blu e che quindi sono morte.

Il protocollo da seguire è uguale a quello descritto un paragrafo dopo questo, ma dopo aver staccato le cellule e messe in eppendorf, prendiamo una aliquota di 50ul di campione e li aggiungiamo a 50ul di colorante, dopo aver risospeso procediamo con la conta vitale; il colorante agisce istantaneamente  nei confronti delle cellule colorandole se morte.

TEMPI DELLA CINETICA DI CRESCITA

Tempo piastramento

Il primo step della nostra cinetica di crescita, non è uno step che comparirà nel grafico finale, in quanto in questa fase noi piastriamo le cellule  in quantità nota per farle crescere e preparale per la cinetica dei giorni successivi.

Il piastramento viene fatto preparando tanti pozzetti quante sono le condizioni  in cui farle crescere , ma tutte le cellule che noi destiniamo alle diverse condizioni in questo momento verranno piastrate con lo stesso terreno e fatte crescere  tutte per un giorno, e da queste cellule piastrate si procederà per il calcolo dei vari punti della cinetica a diversi tempi.

Il piastra mento lo si può fare in due modi, a bassa densità e ad alta densità, si sceglie solitamente la bassa densità per una cinetica di crescita mentre piastramenti ad alta densità li si fa nel caso in cui facciamo delle analisi  in tempi brevi per permettere alle cellule di raggiungere un numero sufficiente (nel nostro caso, con  l’MTS, l’esperimento pilota è fatto partendo da una piastra piastrata ad alta densità).

Tempo = t0

Il primo punto della cinetica corrisponde al tempo 0, dopo il cambio del medium per sostituire i terreni standard con i terreni selettivi, faccio una conta cellulare per ogni piastra.

PROTOCOLLO CAMBIO MEDIUM

Il cambio del medium è una parte semplice ma importante, perché lasciare in coltura per grandi tempi le cellule porta il terreno a “consumarsi” cioè a finire i nutrienti al loro interno impedendo quindi la crescita delle cellule, la procedura consiste in:

• Aspirare il vecchio medium
• Aggiungo PBS per un lavaggio (non lasciare mai le cellule per più di un minuto senza essere immerse in terreno o PBS o si rischia  di farle morire). Questa fase si può saltare solo se il terreno aggiunto dopo non è in difetto di alcuni elementi rispetto al primo, altrimenti è sempre buona cosa fare almeno un lavaggio in modo da togliere ogni residuo del terreno precedente.
• Infine aggiungo 8/10 ml del nuovo terreno che ovviamente sarà uguale a quello aggiunto precedentemente in modo da mantenere eventuali condizioni selettive.

Per poter staccare le cellule e poi contarle si deve seguire un protocollo specifico indicato nel paragrafo successivo, e che va eseguito per ogni punti della cinetica.

Tempo = t24

Dopo aver fatto crescere le cellule per 24h prendo le piastre, stacco le cellule al loro interno e le trasferisco in eppendorf.

Tempo = t48

Al tempo 48 ore attuo la stessa procedura del tempo 24 

Tempo = t72

L’ultimo punto della cinetica(nel nostro caso, a volte una cinetica va ben oltre le 72 ore) lo ottengo sempre grazie alla metodica descritta a tempo 24.

Infine metto tutti i dati un una tabella e osservo la curva cinetica della crescita della nostra linea cellulare.

PROTOCOLLO CINETICA DI CRESCITA

La cinetica prevede un protocollo preciso da attuare a ogni tempo che lo andiamo a fare:

• Aspirare il medium di cultura e fare un lavaggio con una quantità di PBS pari alla metà del terreno aspirato
• Tolgo il PBS aggiunto per il lavaggio e aggiungo la tripsina, enzima proteolitico che permette alle cellule di staccarsi dalla piastra alla quale sono ancorate.
• Metto in incubatore 5 minuti le piastre con tripsina e aspetto che l’enzima faccia effetto (la quantità di tripsina e la durata all’esposizione della tripsina alle cellule deve essere il minore possibile per evitare danni alla cultura)
• Neutralizzo la tripsina con un volume doppio di terreno dopo aver controllato al microscopio che le cellule non siano più adese alla piastra (lo si nota per un cambiamento conformazionale della cellula che diventano più tondeggianti dopo averle staccate)
• Sposto in eppendorf un aliquota della cultura di cellule staccate e proseguo con la conta.

La cinetica di crescita non è necessario che venga svolta in assoluta sterilità, ma la preparazione delle piastre si in modo da evitare che si presentino contaminazioni da parte di muffe o altri agenti esterni.

CONTA CELLULARE

 La conta cellulare è l’ultima fase del protocollo per la cinetica di crescita ed è il dato che noi dobbiamo avere alla fine di questo processo, cioè il numero di cellule medio dei pozzetti contati per linea cellulare a un tempo X. 

          BURKER E CALCOLI

Per la conta cellulare utilizziamo la camera di burker, fatta da un supporto di vetro sulla quale si trova una griglia formata da un quadrato nella quale troviamo iscritto 9 quadrati formati da altri 16 piccoli quadratini.

Per avere una conta efficiente contiamo i  3 quadrati “grandi” in obliquo, mentre per ricavare il dato del numero di cellule facciamo la media dei tre valori ottenuti:

(A1+A2+A3)/3  A_m

Ottenuto il valore A medio lo moltiplico per un valore costante di 10⁴, che si ricava dalla dimensioni dei quadrati della camera di burker

A_m  x   10⁴ = numero di cellule/ ml

Come ultimo passaggio, per ricavare il numero di cellule moltiplichiamo la concentrazione ottenuta per il volume di cellule staccate e ottenere quindi il numero totale di cellule.

(numero di cellule/ ml) x (volume totale ) = numero cellule.

ANALISI DEI “ROS”

INTRODUZIONE

La sigla “ROS” deriva dall’inglese reactive oxygen species (composti reattivi dell’ossigeno)

Si formano durante un normale processo di respirazione cellulare, in particolare dopo il ciclo di krebs, durante tutto il processo della fosforilazione ossidativa.

I ros comprendono un ampia gamma di composti che sono divisibili in due categorie:

I ROS radicali, sono molecole che hanno un elettrone spaiato e sono altamente reattivi, causano gravi danni a strutture biologiche importanti come DNA, proteine o carboidrati

I ROS non radicali, sono molecole che hanno un basso potenziale riduttivo e sono quindi ottimi ossidanti, e a livello biologico si comportano ossidando macromolecole.

Un esempio di ros sono ClO^-, H₂O_2,  O₂^- e composti ossidanti dell’azoto.

Le cellule hanno dei sistemi di difesa contro i ROS, e sono gli agenti antiossidanti che vengono sia introdotti con la dieta sia prodotti naturalmente  dall’organismo; un esempio sono la vitamina C, polifenoli o anche enzimi come la superossidasi dismutasi (SOD)

PROCEDURA

• Piastrare le cellule a bassa densità 17000 cells/cm² in p100
• Dopo 18 h dal piastramento effettuare il cambio medium (con opportuni lavaggi in PBS) e aggiungere il nuovo terreno con le condizioni selettive in cui far crescere le cellule (0 gln, 0,5 gln e 4nM alfa chetoglutarato)
• Al tempo della cinetica desiderato preparo il campione
• Tratto il campione per 30 minuti con 5uM di DCFDA da aggiungere direttamente nel medium di coltura e lasciare il tutto nel incubatore a 37 gradi
• Al termine dei 30 minuti aspiro il medium e lavo con PBS 1X caldo
• Stacco le cellule con tripsina e faccio una conta
• Centrifugo il campione
• Il pellet ottenuto lo risospendo in 4ml di PBS freddo. Centrifugo nuovamente la sopsensione cellulare.
• Infine aggiungo un volume di PBS in modo da avere una concentrazione di cellule di           4 x10⁵\ 5 x10⁵  cells/500 ul 
• Metto il campione in tubi FACS in modo da avere almeno una concentrazione  di 4 x10⁵\     5 x10⁵  cells/tubo;  mantengo le FACS in ghiaccio fino a lettura.

MOLECOLA UTILIZZATA PER ANALISI ROS

La DCFDA è la molecola usata per l’analisi dei ROS, il suo nome è dicloro fluorescina diacetato, è permeabile alla membrana  cellulare e infatti riesce a entrare  all’interno della cellula dove la molecola viene ossidata dai ROS e si trasforma in dicloro fluoresceina (DFC) che è una molecola fluorescente e quindi la sua fluorescenza puo essere misurata e da li calcolare la quantità di ROS che sono stati prodotti dalla cellula.