TEST DI PERDITA PLASMIDICA

Buongiorno a tutti cari lettori, oggi parlerò del fenomeno della perdità plasmidica, un articolo scritto di mio pugno :) a voi.

Quando una cellula implementa nel proprio citoplasma  un plasmide non è detto che poi questa lo tenga fino alla fine della sua vita, può succede che il plasmide introdotto nella cellula per via delle condizioni ottimali di coltura non necessita dell’espressione  dei suoi geni e quindi risulta poco utile alla cellula, ma è comunque una bella spesa a livello energetica, quindi la cellula lo eliminerà esocitandolo all’esterno.

Un buon plasmide

 Un buon plasmide è tale non per i geni che porta al suo interno o meglio non solo per quello ma anche per altre caratteristiche  che deve avere

1 deve essere di piccole dimensioni massimo 200kb in modo che la struttura entrante nella cellula non sia esageratamente enorme

2 deve avere un origine di replicazione in modo da tramandare alle cellule figlie il plasmide, altrimenti questo si perderebbe dopo la prima generazione della cellula trasformata

3 deve avere dei siti marcatori che ci permettono di distinguerle dalle cellule trasformate da quelle in cui il plasmide non è entrato, questa caratteristica è molto importante per isolare le cellule  trasformate

4 nel plasmide c’e la presenza di siti marcatori che non devono essere però coincidenti con i geni codificanti per proteine utili.

Come trasferiamo un plasmide dentro la cellula?

Un plasmide non può entrare spontaneamente all’interno della cellula, a meno che questa non sia competente, batteri come il subtilis sono competenti e fanno entrare plasmidi di piccole dimensioni senza trattamenti particolari.

Nel caso del lievito o coli è necessario renderlo competente per permettere al plasmide di entrare, questa competenza è determinata dall’uso di determinate procedure che vanno dal trattamento fisico a quello chimico

Quello chimico è quello più usato e prevede l’uso di cationi bivalenti come magnesio e calcio sotto forma di Sali con cloruri, oltre a questi due componenti usiamo anche il PEG polietilenglicole.

Poi grazie ad uno schok termico creiamo dei pori sulla membrana plasmatica ( il PEG aumenta la pressione osmotica e aiuta la formazione dei pori)

Il plasmide non entra poi facilmente in questi pori, può succedere che entri per caso ma può essere che il plasmide vaghi nella soluzione senza entrare in alcuna cellula, per questo dobbiamo aggiungere alla soluzione  un dna carrier che veicolerà il plasmide nella cellula.

Adesso quindi sappiamo come il plasmide entra e perché dovrebbe uscire dalla cellula, un modo per calcolare quanto plasmide entra nella cellula è quello di sfruttare il sito di marcatore selettivo del plasmide, in che consiste esattamente? Mettiamo che la cellula di coli che abbiamo trasformato non sia capace di resistere alla ampicillina, ma il plasmide inserito da una resistenza al coli proprio alla ampicillina, per isolare solo quelle colonie trasformate dal plasmide semplicemente piastriamo le cellule su una piastra contenente ampicillina in modo che tutte le cellule che non hanno il plasmide moriranno per effetto del farmaco.

Con questa procedura possiamo calcolare l’efficienza della trasformazione

Efficianza = (numero colonie resistenti)/ (ug di dna)

Un'altra caratteristica cellulare che possiamo calcolare è la percentuale di plasmide che la cellula perde ( si ricorda però che questa percentuale è rilevante unicamente per un tipo di cellula e per le condizioni di coltura, uno stesso ceppo coltivato in due terreni diversi non è detto che abbia la stessa percentuale di perdita plasmidica)

Per calcolare la perdita plasmi dica si esegue un esperimento molto semplice, prendiamo l’esempio del coli fatto prima, piastriamo su terreno completo il nostro coli, un terreno utile per la crescita delle cellule trasformate e per quelle che non hanno il plasmide, lasciamo crescere per qualche notte fino alla piena formazione delle colonie, quando la piastra è pronta la cloniamo su una piastra LD contenente ampicillina, qua le colonie che non sono cresciute sono quelle che hanno perso il plasmide.

Quindi all’atto pratico per il calcolo ci serve la vitalità , che la calcoliamo con un'altra piastra, in pratica noi sappiamo che piastriamo X cellule e che quindi dovrebbero svilupparsi Y colonie uguali a Y<=X quindi facendo (Y/X)*100 otteniamo la vitalità del nostro ceppo.

Dopo di che ci servono il numero di colonie sviluppate sul terreno completo e quello delle colonie cresciute sul terreno selettivo con ampicillina cosi calcoliamo la perdita plasmi dica %

A=numero di colonie sul terreno completo

B=numero di colonie sul terreno selettivo

Perdita plasmidica= ((A-B)/A)*100

In tal modo troviamo la percentuale delle cellule di coli che hanno perso il plasmide e che quindi non riescono a crescere su terreno selettivo.

Lo stesso esperimento possiamo farlo con il lievito   mutato in ADE2, ADE3, e  URA3

I geni per codificare l’adenina sono due, uno codifica per un enzima che forma un intermedio rosso partendo dal precursore l’altro per l’adenina partendo dall’intermedio.

Questa cellula può essere utile per il nostro fine perché introducendo un plasmide ADE2 e URA3  le mutazioni si compensano cosi le cellule con il plasmide dopo la trasformazione  danno origine a colonie rosse, per via dell’intermedio rosso  della via biosintetica dell’adenina, e possiamo separarli dalla cellule non trasformate per via del marcatore selettivo URA3.

Questo esperimento possiamo farlo per avere un idea visiva della perdita plasmi dica, se la colonia è bianca vuol dire che li non c’e il plasmide  se è rossa invece il plasmide c’e.

Per avere un idea quantitativa si svolge lo stesso tipo di esperimento che abbiamo usato per il coli.