PANORAMICA DI DIFFEREZIAMENTO DELLE GONADI NELL’UOMO II

CHE GENI SI ATTIVANO PER LO SVILUPPO DELLA GONADE IN SENSO MASCHILE
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Sviluppo embrionale delle gonadi 

Lo sviluppo delle gonadi inizia durante la 3 settimana d’eta quando le cellule progenitrici migrano verso il mesentere dorsale e posizionandosi li dove andranno a costituire le gonadi, qua avviene un primo spegnimento dei geni che hanno consentito la migrazione di queste cellule e un inizio di mitosi per aumentare la qualità di cellule che andranno a formare le future gonadi. Fino alla 5 settimana però non abbiamo alcuno sviluppo del sesso dell’embrione, malgrado il suo cariotipo sia chiaro gia dalla fecondazione, perché i bottoni necessari per lo sviluppo in senso maschile o femminile non si sono ancora attivati.

Arrivati a questo punto (circa 40 giorni di età) l’embrione presenta sia tratti delle gonadi femminili (canali di Muller) che quelli delle gonadi maschili (dotti di Wolff).

Durante questo periodo oltre alla migrazione delle cellule PCG, abbiamo un ispessimento dell’endotelio con una sua protrusione verso l’esterno lasciando spazio a una massa di cellule mesenchimali indifferenziati, a questo processo segue poi il richiamo di cellule mesenchimali dal mesonefro che formano il cordone sessuale primario.

La differenziazione delle gonadi avviene in base alla presenza o meno del cromosoma Y, alla 7 settimana il gene SRY   inizia a produrre il suo prodotto genico e a far differenziare le gonadi verso testicoli, introno alla 20 esima settimana si iniziano a riconoscere i cordoni seminiferi, e la forma del testicolo, (analisi istologiche hanno osservato che gia dalla 20 settimana di età l’embrione presenza delle cellule differenziate verso le gonadi maschili o femminili). Osservando meglio le strutture testicolari si vede la presenza di strutture parenchimatose con all’interno le cellule di sertoli, spermatogoni primitivi cellule interstiziali.

Lo sviluppo delle gonadi femminili invece non inizia subito come via alternativa alla mancanza del gene Y, ma il differenziamento a cui le gonadi indifferenziate  vanno incontro è più una strada obbligata, dovuto alla mancanza del cromosoma Y. 

Dalla dodicesima settimana di età l’embrione con cariotipo XX inizia a mostrare un differenziamento a livello delle gonadi, con la formazione delle ovaie e delle tube.

Rispetto ai testicoli dove i cordoni delle gonadi si sviluppavano e diventano i futuri dotti spermatici, nelle ovaie questi degenerano lentamente fino alla 20 settimana d’età, e ha inizio lo sviluppo dei follicoli che conterraneo gli oogoni, insieme al tessuto connettivale e cellule interstiziali che costituiscono la volumetria  dell’organo (il riempimento).

La sessualità e il suo sviluppo però non finiscono alla 20 settimana di vita ne alla nascita dell’embrione, finiscono una volta che i testicolo sono scesi dalla cavità addominale e una volta che nelle donne avviene il primo ciclo di mestruazioni.

GATA 4 —> fa parte della famiglia GATA (fattore trascrizionale composto da domini zinc-finger) e gata4 è l’unico espresso nelle cellule somatiche (cellule del sertoli dove è up-regolata mentre è downregolata in quelle interstiziali). Una delezione di questo gene causa una disfunzione testicolare grave in cariotipo XY

GATA 2 —> è espresso  invece nello sviluppo ovarico embrionale

* una mutazione in pV217G causa una forma alterata di GATA4 che crea una condizione anomala grave dei testicoli, in quanto  viene a mancare la via segnale di GATA 4, che prosegue con un interazione proteina-proteina tra GATA4 e FOG2

L’unico gene a regolare davvero la scelta sessuale è stato trovato nel topo (al 10 giorno e quindi alla 5 settimana umana) è il gene SRY che permette la formazione del testicolo è solo questo situato sul’Y, la sua mancanza però porta a uno sviluppo in senso femminile.

A seguire l’attivazione di SRY abbiamo l’attivazione di SOX9.

Come si è stabilito che SRY fosse il gene essenziale per lo sviluppo sessuale? 

1- esperimento di Jost, viene fatto un ovarectomia in embrioni di coniglio con cariotipo XX e una castrazione nell’embrione di coniglio con caritipo XY, prima che però avvenga la differenziazione delle gonadi in ovaie o testicoli. Il risultato mostra che entrambi i feti che sia con cariotipo XX o XY maturano sessualmente vero un fenotipo femminile, ipotizzando che di natura il fenotipo femminile è quello prescelto verso una maturazione “spontanea” si in presenza di gonadi femminili —>ovaia che in assenza completa di gonadi. Ciò ha portato Jost a dire che  lo sviluppo verso un fenotipo femminile in un cariotipo XY normalmente è bloccato da una differenziazione iniziale delle gonadi in testicoli grazie al gene SRY e poi dalla produzione di testosterone che impedisce la degenerazione dei dotti di Wolff che diventeranno successivamente  dotti spermatici e la produzione di AMH che invece favorisce la degenerazione dei dotti mulleriani che in un fenotipo femminile si sviluppano nelle tube.

2- Un altra prova è stata fatta osservando individui XX che avevano sequenze Y e si sviluppavano in senso maschile.

3- Altri esperimenti con topi transgenici che avevano un cariotipo XX ma dove è stato integrato il gene SRY e vedevano un evoluzione del comportamento  maschile

SRY —> codifica per una proteina molto piccola (223 a.a), che contiene un dominio HMG che lega al DNA ed è una regione estremamente conservata, è situato sotto PAR. La mutazione si SRY nel dominio di interazione con il DNA conduce a uno sviluppo di un fenotipo femminile in cariotipo XY (sindrome Swyer), mentre a volte delle traslocazione fanno si che le sequenze a raro effetto di crossing over, come SRY, finiscano sul cromosoma X, facendo si che se quel cromosoma X è fecondato da origine a un embrione con cariotipo XX ma che abbia un fenotipo maschile, inoltre allo stesso modo, il cromosoma Y che ha perso SRY, se fecondasse un ovocita creerebbe un embrione con cariotipo XY ma un fenotipo femminile.

SRY ha un ruolo fondamentale nello sviluppo del sesso.

In ogni caso un maschio XX sarà inferitile perché ovviamente non ha i geni della spermatogenesi.

SRY viene prodotto dalle cellule del sertoli (a livello embrionale) e si è visto che queste stesse cellule poi regolano e orchestrano la formazione delle Gonadi.

L’ espressione delle SRY avviene sono in presenza di cellule somatiche e non germinali, le stesse cellule che producono SRY  poi producono anche SOX9.

(SRY e SOX9 sono prodotti genici che fanno parte della stessa famiglia di fattori trascrizionali, ma il funzionamento di uno, SOX9 è consequenziale alla presenza dell’altro, SRY).

Le cellule del sertoli sono tipiche del testicolo, e hanno una funzione importantissima ovvero quella di produrre SOX9 dopo l’espressione di SRY, la massima espressione di SOX9 arriva nel momento quando l’espressione di SRY è al suo massimo.

Differenziano dalle cellule germinali che costituiscono le gonadi, e sono importantissime per la riorganizzazione dei cordoni sessuali nel testicolo.

Si localizzano nel topo introno alla fase 11,5 e va ricordato che sono cellule somatiche non germinali, preci hanno gia un buon tasso di differenziamento.

SOX9 —> fa parte della famiglia SOX ed è un fattore trascrizionale (la sua mutazione crea gravi fenotipi e patologie ossee perché attiva la condrogenesi oltre che disfunzione a livello dello sviluppo sessuale)

Se abbiamo una mutazione in eterozigosi in SOX9, avviene un sex reversal con un sindrome di displasia campomelica. Per queste ragioni SOX9 è importantissimo per lo sviluppo in senso maschile.

Nei topi con cariotipo XX in cui invece si è andato a far over esprimere SOX9 si ha uno sviluppo maschile anche se non abbiamo SRY.

SOX9 è quindi l’unico target di SRY.

SRY spegne tutti i geni che spingono verso un differenziamento ovarico e accende quelli che spingono verso un differenziamento maschile. SRY ha in comune con SOX9 107 target.

SOX9 è fondamentale per il differenziamento maschile, perché prodotto dalle pre-sertoli consente la formazione dei cordoni e distretti testicolari.

Esperimento con chimere

La presenza di strutture chimeriche XX e XY hanno mostrato che le pre-sertoli fanno evolvere al 90% dei casi a un genotipo XY, mentre tutte le altre cellule somatiche della chimera avevano una disposizione di un 50% di cellule XX e 50% cellule XY.

Il dato mostra che il genotipo delle pre-sertoli è del 90% XY e un 10% XX, questo dato potrebbe essere strano perché per far differenziare le cellule germinali in pre-sertoli è necessaria la presenza del cromosoma Y, dato dalla composizione chimerica della cresta-urogenitale, una volta che le prime cellule sono differenziate iniziano a produrre SOX9 che spinge quindi il fenotipo sessuale verso quello maschile, quel 10% di cellule pre-sertoli che però hanno un cariotipo XX e non hanno quindi SRY, si sono differenziate cosi perché le altre pre-sertoli hanno iniziato a produrre PDG2 che rilasciato svolge una funzione autoctona e paracrina, colpendo le cellule vicine a lei e stimolando l’attivazione del gene SOX9 anche in cellule con cariotipo XX.

Il dato ottenuti ha dimostrato quindi che il fenotipo maschile per manifestarsi non necessita di un 100% di cellule con cariotipo XY e tanto meno di un numero grande di cellule di sertoli vista la possibilità di produrre PDG2 —> Quale è la soglia minima di cellule di sertoli necessaria?

La % di cellule necessarie per spingere verso un differenziamento in senso maschile è la presenza del solo 20% delle cellule di sertoli che grazie al PDG2 permettono la differenziazione in senso maschile  (non è necessaria la presenza di quel 90% vista prima). 

La migrazione delle cellule germinali primordiali è mantenuta dai geni Fragilis e Stella che si spengono quando arrivano nella sede delle future gonadi (mesentere dorsale)

Fragilis —> codifica per una proteina che ha il compito nel favorire l’adesione ma deve inibire l’azione proliferativa 

Stella —> Si pensa avere la funzione di mantenere attivo il rimodellamento della cromatina e processamento del RNA, mentendo cosi le PCG  pluripontenti.

I meccanismi molecolari di formazione dei testicoli sono spesso chiariti e spiegati, anche se non sempre in modo completo, ma per quanto riguarda lo sviluppo sessuale verso il fenotipo femminile non vi è ancora chiaro quale sia il meccanismo molecolare e le cascate intracellulari che portano le PCG a differenziarsi nell’apparato riproduttivo femminile (anche se gli step morfologici sono stati gia documentati e studiati)

Si è osservato la presenza di alcuni bottoni molecolari che sono attivati come controparti del gene maschile SRY, presenti però solo se SRY non c’e, queste molecole sono: DAX1 e WNT4 che spostano il differenziamento a favore delle gonadi femminili.

In verità DAX1 è espresso in modo fortemente up-regolato prima di SRY, ma se poi arriva SRY e poi SOX9, verso il 12 giorno (embrione topo), e questo viene spento viene spento.

DAX1 —> fattore trascrizionale, codificato sul cromosoma X, la parte N terminale contiene sequenze conservate per l’interazione con il DNA, sequenze ripetute LXXLL che permettono l’interazione proteina proteina e la parte c terminale che consente il richiamo di co-repressori.

La funzione principale di DAX1 è quella di inibire i fattori testicolari e quindi far sviluppare le gonadi in senso femminile. Lo stesso gene DAX1 è bersaglio del prodotto di SRY che lo down-regola favorendo quindi la produzione prima di SOX9 e una volta differenziate le cellule germinali, la produzione di testosterone e AMH.

DAX1 è up-regolato nelle cellule prima che venga prodotto SRY, questo è consentito da WTN4, che insieme ala Beta-catenina attivano il gene DAX1 up regolandolo

Modelli murini:

cariotipo XX, DAX1 -/-  Non mette in pericolo lo sviluppo ovarico o differenziazioni a favore del fenotipo femminile

Cariotipo XY DAX1 up regolato, Abbiamo il fenomeno della sex-revers, con un diminuito sviluppo sessuale maschile e ridotto sviluppo testicolare, lo stesso effetto è possibile produrlo con una duplicazione del gene di WTN4.